乳酸菌粉的功效与作用（水产养殖中使用的乳酸菌作用机理）

乳酸菌是一类可发酵利用碳水化合物而产生大量乳酸的细菌的总称；

乳酸菌产生的有机酸、过氧化氢、细菌素等活性物质,可阻止或杀灭病原微生物在体内的定植,因而乳酸菌制品对人体具有良好保健作用。

很多乳酸菌都能产生细菌素,细菌素(bacteriocin)是某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抑菌活性的多肽,抑菌范围不是仅局限于同源的几种细菌,产生菌对其细菌素有自身免疫性。

提取及分离纯化是关系到细菌素的功效评价和结构鉴定的非常关键的一环。

细菌素一般为多肽或蛋白质,蛋白质的分离纯化方法常用来分离提纯细菌素。

已经发现本文所研究的植物乳杆菌能够产生广谱的抑菌物质。根据其性质推测该抑菌物质可能为乳酸菌细菌素类抑菌物质,本试验在已有的研究基础上,对抑菌物质进行分离纯化并进行组成鉴定。

植物乳杆菌是乳酸菌的一种，最适生长温度为30~35,厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH 6. 5左右，属于同型发酵乳酸菌。

此菌与其他乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使水中的PH值稳定不升高，而且其产出的酸性物质能降解重金属；

由于此菌是厌氧细菌（兼性好氧），在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。

在养殖中后期，由于动物的粪便和残饵料增加，会下沉到池塘的底部，并且腐烂，滋生很多病菌，生成大量的氨氮和亚硝酸盐，使底部偷死现象严重。

如果长期使用植物乳酸杆菌，就能很好的抑制底部粪便和残饵料的腐烂，也就降低了氨氮和亚硝酸盐的增加，大量减少了化工降解素的用量，使养殖成本降低。

摘 要:植物乳杆菌发酵产生的抑菌物质经乙醇浸提、Sephadex C-15层析、氨基酸组成分析、反相液相色谱分离及鉴定,发现该植物乳杆菌产生的抑菌物质为一类分子量较小(小于 1000Da),且比较接近,极性不同的多肽。

注释：Da全称道尔顿（Dalton），是分子量常用单位，就是将分子中所有原子按个数求原子量的代数和。蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。多少Da也就表示相对分子质量是多少。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Sephadex G-15,phamnacia原产;透析袋,8000Da,1000 Da,华美生物工程公司;600 Da 超滤膜,购自上海医药工业研究院亚东核级树脂有限公司。

葡聚糖凝胶G-15(Sephadex G-15)本产品白色微球,多孔,性稳定,不溶于水、弱酸和碱溶液, 遇强酸苷键分解。为亲水型凝胶过滤填料。粒径:40-120μm;工作PH值:2-13。每克凝胶膨胀时吸水1.5克。分离范围:肽及球蛋白分离范围100~1500;葡聚糖线性分子100~1500。主要用于凝胶过滤,分离分子量接近的小分子,脱盐,多肽分离,清洗生物提取液,分子量测定。

指示菌为Bacilluscereus;由本校微生物教研室提供;植物乳杆菌发酵液冻干粉自制。

1.2 试验方法

1.2.1 抑菌活性检测方法

抑菌活性检测采用杯碟法。

1.2.2 抑菌物质的初步分离

发酵液冻干粉用95%乙醇浸泡后离心,收集上清液,37℃水浴条件下使乙醇完全挥发,残留物用水(加入水的体积为原发酵液体积的 1/50)溶解,离心收集上清液(以后简称为S1)。用 Folin-酚法来检测 S1 中是否含有肽类物质。

Folin-酚法（Lowry法）最灵敏的蛋白质测定方法之一。

1.2.3 抑菌物质分子量范围的确定

S1 用截留值为 1000Da 透析袋和截留值为 600 Da 的超滤膜进行处理，对比处理前后其活性变化。

1.2.4 凝胶柱层析法分离抑菌物质

S1经Sephadex G-15柱(16mm x60cm)分离,洗脱液为 pH4.0的磷酸缓冲液，流速0.4mL/min,用核酸蛋白检测仪在 280nm 处检测,每 10min 收集一管。将各峰的组分合并,检测其抑菌活性。

1.2.5 抑菌物质的氨基酸组成分析

凝胶柱层析法分离出的活性组分经酸水解(6mol/L HCL,110℃水解 18h)，水解前后分别用氨基酸分析仪分析氨基酸的组成及含量的变化。

1.2.6 反相色谱法分离抑菌物质

凝胶柱层析法分离出的活性组分用反相色谱法进行分离,色谱柱为 ODS柱，检测波长280nm;

用AB两种缓冲液进行梯度洗脱,A 液为 pH4.4 的甲酸铵缓冲液,B液由80%甲醇,20%A液组成；流速为1.00mL/min。

时间程序为 B液在前 30min 的含量为5%,在30min 内 B由5%上升到95%,维持 80min.接着在两分钟内 B液由95%降至5%,然后维持 30min。

结果与讨论

2.1抑菌物质的初步分离

发酵液冻于粉经乙醇浸提后,活性成分存留在 S1中， Folin-酚法检测结果表明 S1中含有蛋白类物质。

2.2抑菌物质分子量范围的确定

膜过滤试验结果表明,截留值为 1000Da 的透析袋和截留值为 600Da 的超滤膜未能将抑菌物质阻留。

因为膜对不同分子量大小的分子截留情况不同,因此可以推断待测抑菌物质的分子量很小,可能小于1000Da,以此为依据,选用 Sephadex G-15 对抑菌物质进行分离。

2.3 凝胶层析法分离抑菌物质

试样经 Sephadex G-15 凝胶层析后,有五个峰出现,如图1所示:洗脱时间分别为 129,192,224，266,335min,按先后顺序分别将其表示为:1,2,3,4,5。

收集各组分浓缩 10 倍后测其抑菌活性,抑菌试验结果见图-2所示,其中的数字分别代表相应峰的组分,6为 pH4.0的磷酸缓冲液。

结果表明 2,3 组分(分别用 AB表示)表现出抑菌活性。显示活性的的两种组分的洗脱时间比较接近,A 为192min,B为224min。

2.4 两种抑菌物质的氨基酸组成分析

2.4.1 A 组分氨基酸分析

A 组分氨基酸分析结果见图-3、图-4 及表-1。A 组分经水解后氨基酸组成有非常明显的变化。

其中,丝氨酸,谷氨酸,脯氨酸,甘氨酸,丙氨酸,鸟氨酸,胱氨酸,缬（xie）氨酸,组氨酸九种氨基酸的含量明显增加,且水解后样品的抑菌活性完全消失。

由此可以推断 A 组分中的抑菌物质主要是由以上九种氨基酸组成的多肽类物质。

2.4.2 B组分氨基酸分析

B 组分氨基酸分析结果 见图-5 和图-6及表-2。

B 组分水解后谷氨酸,甘氨酸,丙氨酸,胱氨酸,缬氨酸,苯丙氨酸,组氨酸七种氨基酸的含量明显增加。

推断B组分的抑菌物质主要是由以上七种氨基酸组成的多肽类物质。

综合以上试验结果可知,虽然用 Sephadex G-15 对抑菌物质进行分离时，AB 组分洗脱时间非常接近,即它们的分子量比较接近,但它们的组成却有较大差异,并可推测 A、B 中的抑菌物质均为多肽，即它们为乳酸菌细菌素类抑菌物质。

2.5 反相色谱法分离抑菌物质

经 Sephdex G-15 分离得到的 A、B 两组分以相同的洗脱条件经过 ODS 进行分离色谱图见图-7,图-8。

A经ODS分离后分别在2.45,57.402,63.965min 处出现3个较为明显的吸收峰;

B经ODS分离后在59.443 和 66.035min 处出现2个较为明显的吸收峰。

这表明,AB 组分是分子量相近但极性不同且氨基酸组成也不同的寡肽类物质。

结论

经乙醇浸提,Sephdex G-15 层析,水解前后的氨基酸分析及反相液相色谱分离对抑菌物质进行分离及鉴定,推测该植物乳杆菌产生的抑菌物质为一类分子量较小( 小于 1000Da),且分子量接近而极性不同的多肽,即细菌素类物质。

对该类抑菌物质的结构进行进一步深入研究,将有利于阐明其活性功能与结构的关系。